微生物學經典技術改進及新技術范例

【字體: 時間:2016年07月01日 來源:生物通

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  包括細菌在內的微生物研究常常需要追蹤和分析這些生物的動態行為,時至今日這些技術已經得到了長足發展,出現了一些新的工具,如熒光蛋白報告基因,經典技術也獲得了新生,如瓊脂糖平板上細菌菌落復雜漩渦和螺旋形生長的定量分析等。同時在過去的二十年里,顯微鏡又卷土重來,通過一些小型,相對廉價的相機,以及日益復雜的圖像分析工具幫助科學家們完成了許多分析研究。

——經典技術改進,以及全新的技術將能幫助微生物學家更深入的進行研究

生物通報道:自從1673年列文虎克用他自己制造的顯微鏡觀察到了被他稱為“小動物animalcules”的微生物世界之后,生物學進入了微生物階段。這些微小的動物具有如此驚人的多樣性,無論是人體腸道,還是海底世界都充斥著它們的身影,但在此后有了DNA的跨時代發現,微生物就不再是研究的寵兒了,不過依然有不少科學家繼續進行對其各種行為的研究。

包括細菌在內的微生物研究常常需要追蹤和分析這些生物的動態行為,時至今日這些技術已經得到了長足發展,出現了一些新的工具,如熒光蛋白報告基因,經典技術也獲得了新生,如瓊脂糖平板上細菌菌落復雜漩渦和螺旋形生長的定量分析等。同時在過去的二十年里,顯微鏡又卷土重來,通過一些小型,相對廉價的相機,以及日益復雜的圖像分析工具幫助科學家們完成了許多分析研究。

The Scientist雜志匯總了一些創新方法,以及經典方法的升級版。

細菌菌群形態分析

早期的微生物學家能通過不同的漩渦和條紋很快的識別出培養皿中的細菌菌株,菌株之間的簡單相互作用也很容易辨別——當競爭性的居住在統一培養皿中生長時,就會形成被稱為Dienes line的邊界,這種邊界用肉眼可以清晰的看到。然而對于更復雜的一些動態過程,我們的肉眼就無法準確判斷,容易出錯了。

來自特拉維夫大學的生物化學與細胞生物學副教授Eshel Ben-Jacob,以及MicroDish公司的首席科學官Colin Ingham利用數學和物理學方法定量分析細菌菌落形態模式。Ingham曾是瓦赫寧根大學的資深科學家,他與Ben-Jacob合作,分析后者實驗室在上個世紀90年代發現的一種模式形成細菌:Paenibacillus vortex(旋渦狀類芽孢桿菌,生物通注),這種細菌被稱為細菌界的“愛因斯坦”,其“智商”在細菌界數一數二。

研究人員利用一些傳統經典的方法觀察菌落模式,細菌群集(Bacterial swarming)方法在正常狀態下可行,但在調控增長條件下,研究人員會給細菌施加不同的脅迫壓力,比如缺乏營養,或者改變濕度。然后他們就會對這些菌群進行染色和成像,從而計算出這些因素對細菌的運動性和模式形成的影響。

“這些都是非常簡單的技術,”Ben-Jacob說,“但你需要觀察菌群生長水平,以此來了解(細菌)相互之間的溝通情況。”

通過兩個研究組的合作,Ingham和 Ben-Jacob發現旋渦狀類芽孢桿菌在軟瓊脂糖上有類似交通管理的形態模式,而在硬瓊脂糖上,這種細菌就會形成復雜的菌群形態,沿著中心點形成漩渦,就像它的名字一樣。

研究人員拍攝了突變細胞的成像圖案,并測量了兩種條件下細菌的形態特征,從而首次定量描述了旋渦狀類芽孢桿菌的群集動力學機制。(BMC Microbiol, 8:36, 2008)

此后研究人員又總結了決定細菌菌落的一些簡單規則(PLOS Comput Biol, 7: e1002177, 2011),并指出了旋渦狀類芽孢桿菌與非運動性真菌煙曲霉(Aspergillus fumigatus)之間的相互作用。

對于技術操作,Ingham強烈推薦了一款公共成像處理和分析軟件:ImageJ,這款軟件由美國國立衛生研究員NIH開發,可以在線下載。軟件還包括了多種針對不同應用的插件。

微生物學家可以利用ImageJ分析拍攝細菌的視頻,分析它們的形狀和動態過程。同時NIH網站也會回答和解決一些用戶的提問,“如果能找到人解答你的難題,那就再好不過了,”Ingham說。


一次追蹤多個細菌

通常情況下,研究人員都需要費力地追蹤在他們視野的單個細菌。細菌單一軌跡有助于得到關于這種細菌運動的一般性結論。然而現在的成像技術和計算機技術已經能幫助研究人員同時捕獲和分析多個細菌軌跡了。

來自倫敦大學學院的Gabriel Rosser看到他的一個同事費盡心力收集了數以百計細菌的活動軌跡,希望能幫助解決這一問題,“我知道他有自己的方法,但是他并不確定如何尋找軌跡的起點,”Rosser說。

為了解決這一問題(不用分別建立追蹤亞集),Rosser與來自牛津大學的Alexander Fletcher合作,研發了新的運算法則,可以一次處理所有的追蹤進程,篩選掉那些軌跡太凌亂或不可能存在的軌跡,“一旦你選擇了一種細菌,那么就有可能出現篩選,”Fletcher說,平常我們都需要篩選那些好的軌跡:更直、更長,更容易地分析,而在這里,計算機幫我們完成了這一工作。

研究人員分析了紅假單胞菌Rhodobacter sphaeroides,這是一種使用單一鞭毛運動,自由游動的桿狀細菌。由于這種細菌很小,因此其周圍分子的隨機布朗運動都會導致它們偏離直線運動,為此研究人員采用了一種稱為“run-and-tumble(運動翻滾,生物通譯)”的方法,在細菌停下來之前進行快遞的旋轉或鞭毛拂動,令其保持短暫的直線運動。

通過新的運算法則,研究人員發現這種細菌翻滾階段的出現并不是隨機的,這與之前科學家們認為的相反,“它們改變得太快,以至于變成了一個被動的過程,”Rosser說。

要進行這種分析,Rosser說,可以在他們的論文中找到詳細的過程(PLOS Comput Biol, 9: e1003276, 2013)。只要是一般采用成像捕獲軟件獲得的細菌軌道都可以用這個工具進行分析,其中的一些應用可能與菌種有關,“但相關的分析具有一般適用性,”他說。


感染期少量細菌如何檢測

許多病原菌,比如結核桿菌在初始生長階段生長的十分緩慢,因此要了解其如何感染宿主的并不容易。至今科學家們還不清楚結核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis在人體內的立足點在哪里,是肺泡?鼻咽?還是散布在全身的病原體?

“如果能在體內追蹤到這些病原體,就是這一領域的一大進步,”來自德州A&M健康科學中心的微生物病理學和免疫學教授Jeffrey Cirillo說。

為了能找到樣品中少量的結核桿菌的蹤跡,Cirillo研究組研發了一種新技術,利用熒光報告基因來檢測——結核桿菌會分泌一種名為BlaC的酶,據此研究人員設計出一種能與這種酶反應的分子,兩者反應后會發出熒光。在此基礎上制成的檢測裝置只需在其中加入痰液,若含有結核桿菌,檢測裝置就會發出熒光。如果自行檢測者拿不準如何判斷熒光,可用手機拍照后傳給專業醫生,無須親自到醫院就能獲知檢測結果。

這種新型檢測方法靈敏度很高,樣本中只含少量的結核桿菌就能檢測出來。與之相比,傳統的利用顯微鏡觀察樣本中是否含結核桿菌的方法,在結核桿菌數量很少時常常判斷困難。

其實之前也有類似的技術,但所用分子不只對結核桿菌敏感,也會引起其他一些種類的細菌產生反應。而這一研究針對這一問題進行改進,所用分子只有遇到結核桿菌分泌的酶時才發出熒光。

這一系統能檢測到樣品中少至10個細菌(Angew Chem Int Ed Engl, 53:9360-64, 2014),Cirillo 還在嘗試研發另外的生物螢光分子(來自螢火蟲)追蹤活體動物中的感染的新系統。、

這一報告系統是在其它研究發現的基礎上研發出來的,Cirillo 研究組進行了一些改動,從Addgene 開放性數據中可以活動這種質粒的信息。


細菌如何被推動的

科學家們已經發現了細菌微生物如何從能在多種結構中游動的秘密,但是不同的細菌如何利用這些結構推動其自身行走依然是個迷,需要通過顯微檢測這些推動力。

鞭毛Flagella是細菌用來游泳和入侵宿主的微小的鞭子狀結構,科學家們發現鞭毛的構建和運轉至少需要50個基因。“但是我們并不知道細菌是如何進行表面移動的,”來自布魯克林學院的Nicolas Biais說。

Biais研究組一直致力于分析細菌上的一種稱為IV pili的結構,Pili又稱纖毛(fimbriae),是毛發樣的粘附結構,感染時幫助細菌在人體細胞上粘附和形成菌落,其它引發人類感染的細菌也產生相似的pili或纖毛,加劇感染。霍亂弧菌Vibrio cholerae 和淋病奈瑟菌Neisseria gonorrhoeae上就這種結構,Biais將它們稱為“小型蜘蛛俠”,因為這些細菌能利用pili拉動自身,與其它細菌相互作用,并吸附到感染宿主的上皮細胞上。

為了研究這種細菌結構,Biais實驗室采用了三種方法,這些方法都能令細菌與其它物體相互作用。首先Biais利用光鑷(ptical tweezers)在細菌中加入了蛋白包裹的微珠,細菌就會爬上這些微珠上。通過檢測微珠移動的位置,研究人員就能了解細菌的拉動力。同時通過顯微相機拍攝這一過程,并利用ImageJ 或 MATLAB進行分析。

但是這種方法有一個弊端,那就是激光會產生熱,改變細菌的行為,為了最大程度的還原細菌的活動,Biais等人有構建了一種聚合物支柱,這類似于計算機的那些模塊芯片。細菌能在這些微柱上移動,就像蜘蛛俠穿過摩天大廈,Biais檢測每個“摩天大廈”的彎曲程度,從而來檢測細菌的運動。

第三種方法是磁鑷(Magnetic tweezers,生物通注),這更便宜,也更容易在不產生熱的條件下發揮作用。同樣研究人員也是將磁珠放到細菌中,檢測它們的行為。不過這些磁鑷不像第一種方法那么靈活,因此大多用于分析那些已知的拉力。

通過組合這些研究工具,Biais 研究組通過對淋病奈瑟氏球菌的研究,發現一束纖毛收縮時的力量可達到單根纖毛的十多倍。這種驅動收縮的分子馬達是已知動力最強的納米生物馬達。這一發現通過對菌毛的研究可以幫助解決各種致病菌的治療難題(PLOS Biol, 6:e87, 2008)。

要想進行這些實驗,首先激光儀器不便宜,而且無論是光鑷,還是磁鑷都需要通過微柱進行校準。相關內容可以參考Biais在一篇文章一個章節中提到的具體內容(Methods Mol Biol, 799:197-216, 2012),其中包括如何制造微柱。另外Biais也在另外一篇文章中詳細介紹了磁珠(Methods Cell Biol, 83:473-493, 2007)。不過鑒于各種細菌拉動力的不同,需要參考研究人員本身的目標細菌。

(生物通:張迪)

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